Prospettive nella terapia immunologica del cancro

Proprietà immunogene di un complesso antigenico estratto da materiale neoplastico (TLP)

Ricerche effettuate

Da tempo la lotta contro il cancro sta vedendo oltre ai tradizionali strumenti chemioterapici, radiologia e chirurgici, l'utilizzo dell'immunoterapia.  In questo senso di particolare interesse risultano i nuovi approcci della terapia immunologica, mediante l'impiego di farmaci che restaurino le riduzioni dell'immunità (causata dal cancro e/o dalle cure citostatiche fisiche e farmacologiche) e l'uso di interferone oppure di cellule killers attivate in presenza di interleuchina-2.

Un altro campo dell'immunoterapia dei tumori che si sta rivelando fecondo è quello dei markers antitumorali.  Il lavoro che il gruppo di ricerca del prof Giulio Tarro svolge con il Centro del prof.  Pederzini di Mantova ha avuto come obbiettivo di ricercare un antigene neoplastico (siglato TLP) sufficientemente immunogenico per indurre nel canceroso uno stimolo oncolitico specifico efficace, studiando nel contempo le possibilità di creare nel paziente una certa permissività allo stimolo antigenico.  Queste ricerche hanno portato ad importanti risultati quali la scoperta della TLP (proteina liberata dai tumori umani) (Brevetto Europeo n. 88830058.9,/1988 The Hague) e l'applicazione di patente europea (N.  RM92A 000506/1992) per peptidi sintetici dell'antigene del carcinoma polmonare.  Anche per queste scoperte il prof.  Giulio Tarro nel luglio 1990 è stato nominato Presidente della Società Italiana di Immunooncologia.

Sintesi delle ricerche

Le correnti di ricerca hanno oggi dimostrato inequivocabilmente la presenza di antigeni associati a tumore (TAA) responsabili: dell'induzione di anticorpi specifici; di reazioni di ipersensibilità ritardata; della blastizzazione dei linfociti periferici di ammalati trattatati con TAA autologo ed omologo, già precedentemente sensibilizzati; della mancanza di blastizzazione di linfociti di individui sani e di individui cancerosi che non siano stati pretrattati con lo stesso antigene.  Sulla base delle esperienze riportate è lecito pensare che il TLP, in quanto immunogeno e mitogeno specifico e, infine, in quanto elemento della dotazione antigenica della cellula neoplastica, possa essere valido per approcci di immunoterapia del cancro.

Le sostanze sono originate da due distinti tessuti tumorali (carcinoma polmonare -TLPI- e carcinoma del colon -TLP2-) distinzione fatta per aumentare le possibilità di congruità delle proteine atipiche nel soggetto affetto con quelle presenti nel preparato.  Molti anni di lavoro sono stati spesi prima di individuare i parametri essenziali dell'antigene T.L.P e successivamente per verificare la sua efficacia come sostanza terapeutica anticancro attraverso la via della stimolazione del sistema immunitario di cui l'organismo è naturalmente dotato.  Il TLP è costituito da lipoglicoproteine «solubili», misura tra 48,1 -61 Angstrom, ha un punto isoelettrico inferiore a 7.0 e presenta un peso molecolare di 214.000 dalton polimero costituito da monomeri di circa 54.000 dalton di cui è stata analizzata prima la costituzione aminoacidica e quindi ottenuta la sequenza.  Il TLP o proteina liberata da tumore è un antigene derivato da masse tumorali asportate chirurgicamente estratte biochimicamente, isolato, purificato.  Di recente gli epitopi o parti prostetiche degli stessi antigeni sono state sequenziate per quanto riguarda alcuni tumori polmonari.

Una ricerca analoga è stata fatta per i tumori del colon mentre altre ricerche si stanno occupando di tumori urogenitali.  Successivamente sono stati ottenuti peptidi sintetici utilizzando i dati di sequenza per le proteine studiate in precedenza e sono stati preparati anticorpi policlonali nei riguardi di questi antigeni.

In conclusione sono stati ottenuti l'analisi strutturale dell'antigene del carcinona polmonare ed è stato sviluppato un anticorpo nei riguardi di quest'antigene con cui si può prospettare lo sviluppo di una metodica diagnostica per l'antigene polmonare connesso con i tumori utilizzando gli antisieri già esistenti con l'obiettivo di una diagnosi precoce del tumore polmonare.  Inoltre gli antigeni sia purificati che ottenuti per sintesi possono essere utilizzati nell'immunoterapia specifica attiva con protocolli già prestabiliti, ottenendo come traguardo sostanze immunogene direttamente dai tumori ovvero prodotti mediante ingegneria genetica.

L'identificazione della sequenza aminoacidica è frutto della collaborazione con il prof.  Giulio Tarro dell'Istituto Fannacoterapiaco Italiano e dei laboratori di biochimica di Cold Spring Harbor dello Stato di New York (USA).  L'analisi strutturale dell'antigene del carcinoma del polmone è stata condotta con successo ottenendo informazioni sulla sequenza aminoacidica.  La proteina è stata trovata essere bloccata alla degradazione di Eldman, fatto non raro.  Le proteine sono state perciò digerite con proteasi per ottenere peptidi utili per l'analisi di sequenza.  La digestione con la proteasi V8 dello Stafilococco aureo è stata provata essere molto utile, e una sequenza è stata ottenuta: X-X-R-T-N-K-E-A-S-I.  Altre due sequenze sono state ottenute da peptidi di una delle proteine digerite Q-G-S-A-X-FT-N e N-Q-R-N-R-D.

Il razionale che ha portato all'identificazione del frammento peptidico descritto, come un epitopo dell'antigene del carcinoma polmonare, ha preso lo spunto da una ricerca condotta dal prof.  Tarro sulla purificazione e caratterizzazione dell'antigene del carcinoma polmonare (TLP) osservando che non era possibile ottenere anticorpi monoclonali immunizzando topi con le proteine intatte.  Si sono costruiti, quindi, peptidi sintetici come antigeni per preparare anticorpi diretti verso siti specifici basandosi sull'informazione della sequenza parziale ottenuta.  La sequenza più valida a questo scopo è quella che è stata confermata in più proteine (R-T-NK-E-A-S-l).  Il procedimento ha implicato la sintesi e la purificazione del peptide con un derivato alfa - carbossiamidico con un residuo terininale di cisteina.  Il peptide è stato accoppiato per via della cisteina a una proteina carriera per lo più l'emocianina estratta da ostriche, usando il reagente MBS (l'estere m - maleimidobenzolico - N idrossisuccinimidico).

I coniugati miscelati con adiuvante sono stati usati per un ciclo di iniezioni sottocutanee o intradermiche nei conigli, seguiti da successive iniezioni con adiuvante incompleto.  I richiami sono stati effettuati ad intervalli di due settimane, dopo un periodo di riposo di quattro settimane per permettere la decantazione della risposta primaria, generalmente IgM.  E' importante, ovviamente, ottenere sieri contenenti IgG che vengono prodotti nella risposta secondaria.  In particolare IgG purificate di sieri reattivi possono essere usati per purificazione di affinità dell'antigene originale del carcinoma polmonare.  Utilizzando questa metodica è stato possibile ottenere con successo lo sviluppo di reagenti proteici specifici da sequenze peptidiche piuttosto brevi.  Dal momento che la proteina è espressa nel carcinoma polmonare, la produzione di anticorpi diretti verso questo antigene porta ad utilizzare un test di screening nei riguardi di estratti polmonari crudi, cioè verso l'antigene proteico e prospetta la preparazione di una «CDNA library» dal materiale tumorale.